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発酵ブロス中のHA含量を分析するには？
はじめに
ヒアルロン酸（HA）は天然に存在する多糖類であり、医薬品、化粧品およびバイオメディカル産業で広く用いられている。HAの生産は通常、細菌株の発酵を伴い、発酵ブロス中のHA含量の分析は、最終製品の品質と純度を保証するための生産工程における重要なステップである。この記事では、発酵ブロス中のHA含量を分析する方法について述べる。その長所と短所を知り、研究やビジネスに適したHA製品を選択できることを願っている。
[1]
図1.HAの化学構造
発酵ブロスを用いてどのようにHAを生産するか？
ヒアルロン酸は従来、雄鶏の櫛から抽出されていたが、抽出率が低いこと、単離工程が複雑であること、そして莫大なコストがかかることから、このアプローチは断念された。現在では、微生物発酵により大規模なHAが生産されており、そこでは生きた微生物中のヒアルロン酸合成酵素によりHAが調製される。これには次のような利点がある。
- 新しい栄養素：吸収に有益ないくつかの新しい物質が作られる。
- 高い抽出率：プロテアーゼ、セルラーゼ、その他の酵素が植物細胞の破裂を促進し、その過程で有効成分の放出を促進するため、結果的にHAの収量と抽出率が高まる。
- 吸収しやすい：ポリペプチド、多糖類、その他のナノサイズの低分子が生成され、吸収されやすくなる。
- 副作用が少ない：微生物細胞は有害物質を分解し、安全でない要因を減らすことができる。
[2]
図2.HPLCシステム構成図
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発酵ブロス中のHA含量を分析するには？
ヒアルロン酸生産の効率、生産性、純度を向上させるために、数多くの技術が採用されてきた。その中で、発酵過程におけるHA含量の分析にはいくつかのアプローチが用いられている。
- 塩化セチルピリジニウムによる沈殿
塩化セチルピリジニウム(CPC)による沈殿は伝統的な分析法で、540 nmでの分光光度計による測定が行われる。しかし、他の多糖類からの干渉や精度の低さなどの限界がある。
このようなCPCの限界を克服するために、近年さまざまな分析法が開発されている。そのような方法の一つが高速液体クロマトグラフィー（HPLC）である。HPLCはHA分子をその分子量に基づいて分離し、次いでUV検出器を用いて検出する。HPLCはその高感度、高精度、高選択性により広く採用されている。発酵ブロス中のHAの分子量と含量の両方を分析するためにHPLCを用いることができる。
最近注目されているもう一つの方法は、キャピラリー電気泳動（CE）である。CEは高分解能分析技術で、電荷対サイズ比に基づいてHA分子を分離する。これは発酵ブロス中のHAの分子量と含量の両方を、高分解能、低サンプル消費量、短時間分析で分析できる。
- 赤外分光法
近年、既存の分析法の限界を克服する新しい分析法を開発する努力がなされている。例えば、赤外分光法（IR）に基づく新しい分析法が開発された。この方法ではHA分子の吸収スペクトルを直接測定し、その結果を検量線と比較してHA含量を決定する。この方法には、高感度、低コスト、簡単な試料調製といった利点がある。
- その他の方法
さらに他の方法も生み出されている。例えば、質量分析（MS）を用いて、HA分子から生成されるイオンを検出することにより、HAの分子量と含量を分析することができる。ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)も、分子量に基づいてHA分子を分離するのに適用でき、その後に205nmでの分光光度計による測定が行われる。
表1はこれらの方法の長所と短所を示している。より詳しくはこちらをご覧いただきたい。
表1.HA含量の異なる分析法の比較
|
|
プロセス |
検出 |
利点 |
欠点 |
|
塩化セチルピリジニウムによる沈殿 |
塩化セチルピリジニウムによる沈殿； |
540nmの分光光度計による測定； |
試薬や装置が少なくて済む； |
他の多糖類と干渉する； 精度が低い； |
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高速液体クロマトグラフィー |
分子量に基づいたHA分子の分離； |
UV検出器を用いる； |
高感度、 高感度、高精度、高選択性； |
高価な装置と訓練された人員を必要とする； 時間がかかる； |
|
キャピラリー電気泳動 |
電荷対サイズ比に基づくHA分子の分離； |
UV検出器と光学系を用いる。 |
高分解能； サンプル消費量が少ない； 分析時間が短い； |
特殊な装置と専門知識を必要とする； 電極汚染の影響を受けやすい； |
|
赤外分光法 |
HA分子の吸収スペクトルを直接測定する； |
赤外分光計を用いる。 |
高感度； 低コスト； 試料調製が簡単； |
正確さに欠ける； 不純物や汚染物質が測定を妨害することがある。 |
結論
一言で言えば、発酵ブロス中のHA含量の分析はHAの生産にとって非常に重要である。様々な分析法が開発されており、それぞれに限界と利点がある。分析法の選択は、サンプルマトリックス、要求される感度と精度、利用可能な装置と資源などの要因に依存する。新しい分析法の開発は、発酵ブロス中のHA含量の分析の精度、感度および費用効果を改善するために不可欠である。
Stanford Advanced Materials (SAM)は、様々なグレードと分子量の高品質ヒアルロン酸の信頼できるサプライヤーである。ご興味のある方はお問い合わせください。
参考文献
[1] Wang, Yan & Cai, Li-Quan & Nugraha, Bramasta & Gao, Yi & Leo, Hwa. (2013).複雑な組織の修復と再生のための現在のハイドロゲルソリューション。Current medicinal chemistry.21.10.2174/0929867321666131212151855.
[2] Czaplicki, Sylwester.(2013).Chromatography in Bioactivity Analysis of Compounds.10.5772/55620.
Chin Trento
