{{flagHref}}

製品

製品
カテゴリー
ブログ
ポッドキャスト
応用
ドキュメント

|

/ {{languageFlag}}

問い合わせ

a

鉄触媒を用いたsp 3 C-CH官能基化による炭素-炭素結合の酵素的構築

タイトル	鉄触媒を用いたsp 3 C-CH官能基化による炭素-炭素結合の酵素的構築
著者紹介	Ruijie K. Zhang 1 , Kai Chen 1 , Xiongyi Huang 1 , Lena Wohlschlager 1 , 2 , Hans Renata 1 , 3 , Frances H. Arnold 1 , *.
雑誌	自然
日付	12/19/2018
土居	10.1038/s41586-018-0808-5
はじめに	炭素-水素(C-H)結合は、有機分子に広く存在するものの、一般的には反応性が低く、化学的操作の課題となっている。C-H官能基化技術における最近の進歩は、この視点を変えつつあり、炭化水素骨格内にsp3炭素-アルキル基を選択的に導入することの重要な必要性を浮き彫りにしている。本研究では、カルベンC-H挿入によるsp3炭素-H結合のエナンチオ、位置および化学選択的な分子間アルキル化が可能な最初の鉄系触媒を紹介する。これらの触媒は、シトクロムP450酵素（具体的には、システインからセリンへの軸配位子置換を持つ「シトクロムP411」変異体）に由来し、完全に遺伝子コードされ、バクテリア内で生産される。定向進化によって、その活性と選択性を正確に調節することができる。最も豊富な遷移金属である鉄を、この要求の厳しい化学反応に利用することは、従来C-H官能基化の分野で主流であった貴金属触媒に代わる貴重な選択肢となる。研究室で精製された酵素は、ベンジル結合、アリル結合、またはα-アミノC-H結合を含むさまざまな基質を効果的に官能基化し、高い回転率と卓越した選択性を示す。さらに、これらの高効率酵素は、様々な天然物への合理的な合成経路の創出を促進する。これらの酵素が固有の鉄-ヘム補酵素を用いてsp3 C-Hアルキル化を仲介することが示されたことで、この生物学的変換における天然ヘムタンパク質の多様性の有用性が広がり、化学および合成生物学における新規な酵素的C-H官能基化反応の進展が促進される。生物システムは、有機分子の構築において、炭素-炭素（C-C）結合形成のための限られた化学的戦略を採用している。多くの方法は官能基の操作に依存しているが、ラジカルS-アデノシルメチオニン（SAM）ファミリーのような特定の酵素はsp3 C-H結合のアルキル化を行うことができる。このアプローチは、構造の多様化において非常に汎用性が高いことが証明されており、多様な天然物や補酵素の生合成において重要な役割を果たしている。しかしながら、この変換のための既存の生物学的メカニズムは、メチル基を転移するか、活性化されたラジカルアクセプター基質を特定の分子に結合させる酵素に限られており、メチル化はラジカルSAM酵素によるsp3 C-アルキル導入の一般的な様式である。本研究は、生物学的に広く行われているC-H酸素化というC-H官能基化プロセスからヒントを得て、sp3 C-H結合アルキル化の新しい酵素的戦略を確立することを目的とした。シトクロムP450酵素は、ヘム補酵素を用いてC-H酸素化を達成し、分子状酸素を活性化して、基質のC-H結合に選択的に挿入できる高エネルギーの鉄-オキソ中間体を生成する。同様に、ヘムタンパク質とジアゾ化合物との組み合わせは、タンパク質に閉じこめられた鉄-カルベン種を生成し、この鉄-カルベン種が第二の基質と選択的なC-H挿入反応を行うという仮説が立てられた。ヘムタンパク質は、シクロプロパン化やヘテロ原子-水素結合挿入などのカルベン転移を行うことが示されているが、sp3 C-H結合の官能基化は依然として困難であった。低分子の金属-カルベンsp3 C-H挿入、特に分子間および立体選択的な挿入は、通常、ロジウム、イリジウムなどの遷移金属錯体に依存している。カルベンC-H挿入のための人工金属タンパク質は、アポヘムタンパク質変異体にイリジウム-ポルフィリンを組み込むことによって設計されてきた。まれではあるが、鉄-カルベンのsp3 C-H挿入の例も存在する。これらの鉄触媒反応は、しばしば高温を必要とするか、化学量論的であるか、分子内過程に限定され、鉄-カルベンによるC-H挿入の活性化エネルギー障壁が高いことを示している。しかしながら、酵素のタンパク質の足場が反応速度を著しく向上させ、そうでなければ反応しない補酵素に活性を与えることさえあることを考えると、定向進化によってヘムタンパク質を再構成し、鉄-カルベンC-H挿入反応の障壁を克服し、この新しい機能を獲得することができると予想された。初期の研究では、シトクロムP450、シトクロムc、グロビンのホモログの変異体を含む78種類のヘムタンパク質のパネルをスクリーニングした。これらのヘムタンパク質を大腸菌細胞内で、p-メトキシベンジルメチルエーテル(1a)およびジアゾ酢酸エチル(2)と嫌気条件下、室温で反応させた。反応後、C-Hアルキル化生成物3aの生成について分析した。つのスーパーファミリーのヘムタンパク質は、このプロミスキャス活性を低レベルで示したことから、多様なタンパク質構造を持つC-Hアルキル化酵素の創製が可能であることが立証された。Bacillus megaterium由来のシトクロムP450BM3の変異体（シトクロム "P411"）P-4 A82Lは、軸システインからセリンへの変異を特徴とし、13ターンオーバー（TTN）の3aを生産した。さらに、Y32G変異を持つRhodothermus marinus由来の一酸化窒素ジオキシゲナーゼ（Rma NOD Y32G）は、7 TTNで反応を触媒した。第2のアルカン基質である4-エチルアニソール(1i)も、ターンオーバー数は低いものの、これらの新生C-Hアルキル化酵素によって処理された。ヘム補酵素単独（鉄プロトポルフィリンIX）またはウシ血清アルブミン存在下では活性を示さなかった。 P411 P-4 A82Lを最初の鋳型として、C-Hアルキル化の活性とエナンチオ選択性を向上させた生体触媒を同定するために、部位飽和変異導入と全大腸菌細胞を用いたスクリーニングを連続して行った。変異導入の対象としたアミノ酸残基は、活性部位ポケットを覆うもの、ループや他の柔軟なタンパク質領域に存在するもの、または求核性側鎖を持つものであった。改良された変異体は、p-メトキシベンジルメチルエーテル(1a)と4-エチルアニソール(1i)を用いた清澄化大腸菌溶解液との反応で評価された。突然変異誘発とスクリーニングを5回繰り返した結果、変異体P411-gen6が得られ、60TTNの生成物3aが得られた。本来のモノオキシゲナーゼ活性とは異なり、C-Hアルキル化プロセスは酵素のFADとFMNドメインからの還元当量を必要としない。これらのドメインはC-Hアルキル化には必要ないのではないかと考え、P411-gen6の系統的切断を行い、触媒活性に必要な最小限のドメインを確認した。興味深いことに、全長タンパク質のアミノ酸の37％を占めるFADドメインを除去すると、より高いC-Hアルキル化活性を持つ酵素が得られた：P411ΔFAD-gen6は100 TTNで3aを生成し、P411-gen6に比べて1.7倍増加した。このことは、FADドメインがC-Hアルキル化活性に対して負のアロステリック効果を発揮している可能性を示唆している。これらの切断酵素を用いたさらなる検討により、全大腸菌細胞、清澄化大腸菌細胞溶解液、および精製タンパク質としての有用性が確認された。さらに8回の変異導入とスクリーニングを行った結果、P411-CHF（P411ΔFAD C-H官能基化酵素）が得られた。P411-CHF は、P-4 A82L と比較して 140 倍の活性向上を示し、優れた立体選択性で 3a が得られた (2020 TTN、96.7:3.3 e.r.、清澄化大腸菌溶解液を使用)。その後の研究により、TTN を大きく変化させることなく、より低い温度（例えば、4 ℃）で反応を行うことで、立体選択性をさらに改善できることが示された。酵素的C-Hアルキル化は、ミリモルスケールで行うことができる。1.0 mmolの基質1aを用い、P411-CHFを含む大腸菌を4℃で培養すると、82%の単離収率、1060 TTN、98.0:2.0 e.r.で3aが得られた。 C-H挿入ステップの性質を理解するために、予備的な機構解明を行った。基質1aまたは重水素化基質1a-d2を含む反応の独立した初期速度から、P411-CHFが触媒するC-Hアルキル化反応の通常の速度論的同位体効果（KIE）は5.1であり、C-H挿入が速度を決定することが示された。P411-CHFを含む大腸菌を用いて、ジアゾ酢酸エチルとのカップリングについて様々なベンジル基質を評価した。芳香環上の電子が豊富な官能基も電子が不足した官能基もよく耐え、環状基質も適切なカップリングパートナーとして機能した。アルキルベンゼンは、二級ベンジルsp3 C-H結合の官能基化に成功した。特に、三次および二次ベンジルC-H結合の両方を持つ基質1lの生体内変換では、P411-CHFはC-H結合解離エネルギー(BDE)が高いにもかかわらず、二次位置を優先的に官能基化した。ジアゾ酢酸エチルから生成したカルベン中間体は、アクセプターのみのクラスに属する。一般的なドナー/アクセプター型カルベンとは異なり、アクセプター型カルベン中間体はより親電子的であるため、低分子触媒にとって、このカルベンクラスとの選択的反応は重要な課題である。我々の発見は、P411-CHFがこの反応性の高い中間体を管理し、高いエナンチオ選択性で目的のsp3 C-Hアルキル化生成物を提供できることを示している。酵素は、反応サイクルを通して基質や中間体と複数の相互作用を形成する能力を持つため、卓越した反応選択性を達成することができる。タンパク質の足場を改変することで、与えられた基質に対して異なる反応結果にアクセスする相補的な酵素を作り出すことができるという仮説が立てられた。P411-CHFに、C-Hアルキル化とシクロプロパン化の両方が可能な基質である4-アラニソール(1m)を反応させたところ、C-Hアルキル化生成物3mが25:1以上の選択性で優勢であることが観察された。対照的に、P411-CHFと比較してヘムドメインに13の変異を持つP411全長変異体P-I263Fは、シクロプロパン生成物3m''の形成のみを触媒した。さらに、鉄-カルベンとシランの反応性が知られているにもかかわらず、基質1hを反応に用いた場合、P411-CHFはC-Hアルキル化生成物3hを生成した（Si-CH挿入生成物3h''も観察されたが、その生成はP411-CHFによって触媒されなかった可能性がある）。逆に、P-I263Fとの反応では、Si-CH挿入生成物のみが得られた。これらの例は、タンパク質触媒のアミノ酸配列を変えるだけで、異なる生成物が得られるという、高分子酵素の顕著な特徴を強調している。酵素的C-Hアルキル化は、ベンジリックC-H結合の官能基化にとどまらない。アリルまたはプロパルギルC-H結合を含む構造的に異なる分子は、この化学の優れた基質である。剛直なベンゼン環を特徴とする化合物1a-1mとは異なり、化合物4a-4cおよび4eは柔軟な直鎖アルキル鎖を有する。エナンチオ選択的なアルキル化に成功したことから、酵素活性部位が、カルベン中間体に対して好ましい基質の向きを保ちながら、基質のコンフォメーションの柔軟性に対応できることが示唆される。この生物変換の有用性を示すために、この方法論をリングビック酸の正式な合成に応用した。海洋シアノバクテリアはこの万能生体分子を天然物のマリンガミドファミリーに組み込んでおり、全合成アプローチでは戦略的中間体としてリングビン酸を利用することが多い。P411-CHFを含む大腸菌を用い、中間体5aを2.4 mmolスケールで、単離収率86%、2810 TTN、94.7:5.3 e.r.で生産した。その後の水素添加と加水分解により、(R)-(+)-6が定量的に得られ、これはさらに脱炭酸的アルケニル化により(R)-(+)-リングビン酸に加工できる。基質範囲の調査の一環として、P411-CHFはアルキルアミン化合物に適用された。このような化合物は、アミン官能基が触媒に配位して阻害したり、望ましくない副反応（イリドの形成やそれに伴う転位など）を引き起こしたりするため、C-H官能基化法では一般的に困難が伴う。ベンジリックC-H結合とα-アミノC-H結合の両方を含む基質7aまたは7bでは、P411-CHFは対応するα-アミノエステル生成物を高効率で得た。α-アミノC-H結合に比べ、ベンジルC-H結合の結合解離エネルギー（BDE）は一般に低いにもかかわらず、ベンジルC-H挿入は観察されず（7aの場合）、また有意に減少した（7bの場合）。さらに、N-アリールピロリジン(7c-7e)は、α-アミノsp3位で選択的にアルキル化され、優れた基質であることが証明された。P411-CHFを用いると、7cのsp3 C-Hアルキル化は、他のカルベン転移系がしばしば好むアリール環のフリーデル・クラフツ型反応を凌駕した。さらに、アルキル化生成物8dは、医薬化学的応用に関連する構造モチーフであるβ-ホモプロリンの合成のための最も妥当なルートを提供する。 P411-CHFは一級および二級α-アミノC-H結合の両方をアルキル化することから、これらの位置に対する酵素の選択性を調べた。アルカン基質としてN-メチルテトラヒドロキノリン7fを用いると、P411-CHFは1050 TTNでα-アミノエステル生成物を供給し、位置異性体（C2:C1）の比率は9:1で、8fに対しては73.0:27.0 e.r.であった。テトラヒドロキノリン環は天然物や生理活性分子中の特権的な構造モチーフであるため、その選択的官能基化はアルカロイド合成の簡潔な戦略を提供する可能性がある。7fのアルキル化に対する選択性を高めるために、P-4 A82LからP411-CHFまでの進化経路に沿った変異体を評価した。P411-gen5は、さらに高い位置選択性を示し、逆立体優先の生成物を提供した。3.0mmolスケールの反応で、P411-gen5を含む大腸菌は、優れた選択性（1310 TTN, >50:1 r.r., 8.9:91.1 e.r.）で85%の収率で8fを得た。わずか数ステップで、酵素生成物はアルカロイド(R)-(+)-cuspareineに変換することに成功した。最後に、異なるアルキル基の導入について調べた。様々なジアゾ試薬を利用することで、酵素的C-Hアルキル化は、7aのような1つのアルカン基質を複数の生成物に多様化できる。ジアゾ基質の範囲はエステル系試薬にとどまらない。ワインレブアミドジアゾ化合物9cとジアゾケトン9dが酵素的C-Hアルキル化に関与することが観察され、それぞれ生成物10cと10dが得られた。しかし、カルベンのα位での付加的な置換は、一般にP411-CHFや現在の関連酵素ではあまり許容されない。10bを除いて、二置換カルベン試薬を含む反応は、所望の生成物を大量には得られなかった。この研究により、シトクロムP450がsp3 C-H結合からC-C結合を構築する能力を獲得できること、そして活性と選択性の両方が、定向進化によって著しく改善されることが証明された。自然界には、反応の範囲をさらに拡大し、他の選択性を達成するための、膨大な数の代替出発点の可能性がある。シトクロムP450スーパーファミリーは、その本来の酸素化化学のために、膨大な種類の有機分子を処理することができる。P411由来の酵素と、より広範な天然のヘムタンパク質の多様性を利用して、自然のC-H酸素化触媒に特徴的な範囲と選択性を再現するC-Hアルキル化酵素ファミリーを作り出すことができると想定されている。
引用	Ruijie K. Zhang, Kai Chen and Xiongyi Huang et al. 鉄触媒を用いたsp3 C-CH官能基化による炭素-炭素結合の酵素的会合。Nature.2018.Vol.565(7737):67-72。DOI: 10.1038/s41586-018-0808-5
エレメント	カーボン（C） , 水素 (H) , ロジウム（Rh） , イリジウム（Ir） , ケイ素 (Si) , 酸素 (O)
材料	化学化合物 , バイオポリマー
テーマ	バイオメディカル材料
産業	化学・薬学 , 化学製造 , 製薬業界 , リサーチ＆ラボラトリー , 医療機器

関連論文

読み込み中... お待ちください...

SAMのウェブサイトに研究・論文を掲載する。

免責事項

このページでは、ユーザーが関連情報を簡単に検索できるように、学術論文のメタデータのみを提供しています。論文への完全なアクセスには、DOIを使用して元の出版社のウェブサイトをご覧ください。データは一般に公開されている学術データベースから入手したもので、これらのプラットフォームの利用規約に準拠しています。直ちに対処いたします。

成功登録が完了しました

登録が完了しました！この送信者からの素晴らしいメールを受信するために、すぐに受信箱をチェックしてください。

著作権 © 1994-2025 Stanford Advanced Materials所有 Oceania International LLC, all rights reserved.